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WB的問題

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留言31則留言，7人參與討論
推噓3 ( 3推0噓28→ )
很久沒有做了，這幾天做了2次，都是上了ECL肉眼可以看到band，但冷光儀完全照不到， 請各位大大解惑 https://i.imgur.com/gNChHyL.jpg
WB的問題
-- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.137.114.160 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1704522937.A.8ED.html

31 則留言

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Bows, 1F
protocol 沒拿出來是要通靈嗎，我通靈一下應該是一抗或二抗

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Bows, 2F
太濃

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florasflanaa, 3F
ECL肉眼可以看到bend就燒掉了吧

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florasflanaa, 4F
你蛋白下多少？一二抗的濃度是多少？貨號是什麼

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florasflanaa, 5F
host和size有沒有仔細對照過ref.? ECL什麼等級？

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florasflanaa, 6F
有沒有壓過ponceau S和gel stain確認transfer效率

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a9044831108, 7F
Sample的蛋白質濃度不確定，膠是用10 well，每個load

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a9044831108, 8F
20ul，現在用60V跑，再用90V跑，transfer用90V 80mi

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a9044831108, 9F
n，Blocking 用5% milk 室溫1hr，1抗:CD-80(gtx04260

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a9044831108, 10F
)1:1000 in 5%milk，4度overnight，2抗:rabbit(無貨

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a9044831108, 11F
號）1:5000 in 5%milk，室溫1hr，ECL（沒記貨號之後

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a9044831108, 12F
補充）

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a9044831108, 13F
之後strapping ，Blocking，1抗:GAPDH(abcam) 1:1000

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a9044831108, 14F
in 5%milk，4度overnight，2抗:mouse(無貨號）1:100

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a9044831108, 15F
0 in 5%milk

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a9044831108, 16F
之前另外一位有跑出來，冷光儀有照到，但我是什麼都

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a9044831108, 17F
沒照到，肉眼就看得到band

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a9044831108, 18F
太久沒做，不確定是不是哪個沒配好

推

ysfang623, 19F
先確定冷光儀操作有沒有問題，sample能不能序列稀釋？

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ysfang623, 20F
還有internal control 有沒有訊號

推

cyc5566, 21F
肉眼可見，大概幾秒就燒掉了

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xxtomnyxx, 22F
有一個很蠢但我還真看過有人發生的可能......

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xxtomnyxx, 23F
1抗 and/or 2抗完沒有wash就直接加ECL.....
冷光儀操作沒有問題，sample的量是照著前人load，重點是internal control也照不出來，每個1抗跟2抗之間都有wash。後來二抗有調整濃度，改1:10000，也完全照不到，肉眼都看得到，Protocol都是照著前人的，現在已經做到不知道哪裡有問題了
※ 編輯: a9044831108 (223.137.114.160 臺灣), 01/10/2024 11:57:51

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blence, 24F
我想猜冷光儀,因為冷光儀已經可以可見光拍,沒必要另開手機

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blence, 25F
而且我有超過一整年沒做WB,冷光拍要切換直接忘掉了

推

florasflanaa, 26F
你是說同時間做有人跑出來你沒有，還是時間有間

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florasflanaa, 27F
隔？有間隔的話也可能有東西過期壞掉，去跟隔壁

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florasflanaa, 28F
實驗室借sample和抗體當postive做看看，至少

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florasflanaa, 29F
internal ctrl要出來確定你的手法和儀器操作沒問

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florasflanaa, 30F
題，然後才能從材料檢討

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florasflanaa, 31F
ECL最好也先跟別人借用